Родился в Майнце, сменил фамилию отца Генсфляйш на фамилию матери – Гутенберг. После 1420 семья была изгнана из города по политическим мотивам (в Майнце тогда происходило бурное противостояние патрицианских родов и ремесленных цехов) и обосновалась в Страсбурге. Неизвестно также, где Гутенберг обучался ремеслу, но уже в 1434 был признан мастером в Страсбурге, в 1438 стал компаньоном Андреаса Дрицена и братьев Хейлманнов, Андреаса и Антона, согласившись обучить их некоторым «тайным искусствам», в том числе искусству книгопечатания. Смерть Дрицена в конце того же года послужила причиной судебной тяжбы, в ходе которой два его брата требовали признать за ними компаньонские права покойного. В материалах суда содержатся самые ранние сведения о деятельности Гутенберга. Тяжба разрешилась в пользу Гутенберга, и он остался работать в Страсбурге. В 1448 вернулся в родной Майнц, где заключил соглашение об «изготовлении книг» с Иоганном Фустом (или Фаустом), золотых дел мастером, ссудившим ему 800 гульденов под залог некоего аппарата, который Гутенберг обязался для него изготовить. Кроме того, Фуст взялся выплачивать ему ежегодно 300 гульденов.
Гутенберг обращался за деньгами еще несколько раз, и в 1455 Фуст потребовал возврата своих вложений. Гутенберг не желал либо не мог вернуть требуемую сумму, и хотя решения суда до нас не дошли, скорее всего, он был вынужден отдать бывшему партнеру и свой печатный станок, и весь набор. Именно этим можно объяснить тот факт, что крупноформатная 42-строчная латинская Библия ин-фолио, или Библия Мазарини, первая дошедшая до нас книга, напечатанная с помощью набора из подвижных литер, часто называемая Библией Гутенберга, была на самом деле в 1456 выпущена Фустом совместно с Петером Шёффером с наборных досок, которые подготовил Гутенберг. Вполне вероятно также, что, работая вместе с Фустом над 42-строчной Библией, Гутенберг одновременно напечатал 36-строчную Библию, известную как Бамбергская Библия (называемую также Шелхорнской Библией, или Пфистерской Библией), а также папские индульгенции 1454.
После 1458 Гутенберг постоянно испытывал финансовые затруднения. Известно, что некий доктор Конрад Гомери (или Гумери), член майнцского совета, предоставил Гутенбергу инструменты и набор, необходимый для работы. По мнению некоторых исследователей, Католикон Иоганна Бальба от 1460 был напечатан именно этими шрифтами. Другие историки приписывают издание Католикона Гейнриху Бехтермюнце или Петеру Шёфферу. Самому Гутенбергу его изобретение так и не принесло достатка, хотя конкурирующая типография Фуста и Шёффера успешно развивалась вплоть до захвата Майнца Адольфом II в 1462. Последние годы жизни Гутенберг провел в Майнце либо в соседнем Эльтвиле, и в 1465 курфюрст Нассау Адольф сделал его придворным бенефициарием.
Умер Гутенберг в Майнце 3 февраля 1468.